发布日期：2024-05-10 11:32 点击次数：105
口服给药具有无创性，是一种理念念的给药途径，但关于很多类型的化合物仍弗成行。要是靶点在肠说念内，该药物必须不详在上消化说念（GIT）的酸性和卵白水解条目下糊口，并可能被微生物卵白酶降解。这使得口服生物药物具有挑战性。
噬菌体（phages）是一种原核病毒，以在感染进程中将宿主机制导向噬菌体编码基因的抒发而闻明。本护士淡薄一个假定，即一种调养性卵白不错被编码到一个毒性噬菌体中，从而在一个常驻肠说念细菌感染进程中与噬菌体基因共抒发，然后通过噬菌体磋商的细胞裂解开释到细胞外。此外，还假定噬菌体-细菌的共存将导致噬菌体编码基因的握续产生。
在此，弗吉尼亚理工学院Bryan B. Hsu和Liwu Li说明了基因工程毒性不错用来再行编程细菌来抒发和开释调养性卵白。磋磨护士履行以“Sustained in situ protein production and release in the mammalian gut by an engineered bacteriophage”为题发表在《Nature Biotechnology》。最初，本护士说明了当超折叠绿色荧光卵白（sfGFP）基因在宿主细菌和噬菌体的基因组中被编码时，强毒性噬菌体T4将大宗细胞内产生的荧光标志卵白sfGFP开释到培养裂解液中。然后，通过小鼠模子标明，单剂量编码sfGFP基因的噬菌体不错在小鼠黏膜中大宗原位产生sfGFP。终末，在两个小鼠模子中说明了本护士淡薄的设施的可行性。
在第一个模子中，使用T4噬菌体抒发丝氨酸卵白酶阻扰剂B1a（serpin B1a）卵白阻扰促炎酶中性粒细胞弹性卵白酶（NE）的活性，该酶在结肠炎进程中上调。在第二个模子中，使用T4噬菌体抒发卵白ClpB，卵白ClpB具有一个不邻接的5个氨基酸基序，与厌食神经肽α-促黑激素（α-MSH）同源，不错磋商饱腹感以减少痴肥技巧的体重加多。护士发现，在饮食磋商痴肥（DIO）小鼠模子中，策画抒发ClpB的T4噬菌体不错减少体重加多。总之，本护士标明，毒性噬菌体不错用来抒发和开释对哺乳动物宿主具有生理作用的异源卵白。
护士履行
如图1a所示，假定细菌被一个强毒性噬菌体感染会使细胞内卵白开释到细胞外环境中。将T4噬菌体与抒发sfGFP基因的大肠杆菌K-12菌株孵育。在后文顶用“sfgfp”暗意该基因，用“sfGFP”暗意sfgfp基因的卵白产品。如图1b所示，与不含噬菌体培养的细菌（~7×103 AU/OD）比拟，含T4噬菌体的荧光大肠杆菌培养物在上清液中每个细胞有更多的荧光（~0.5-1.0×106AU/OD）。以上数据标明T4噬菌体促进细胞内卵白开释到细胞外。
图1 噬菌体磋商的细菌裂解开释细胞内卵白质
接下来量化在细菌细胞感染进程中是否不错产生并开释大宗噬菌体编码的异源卵白。早期T4噬菌体开动子转录优于宿主开动子，部分原因是前者开动子强度更大，宿主RNA团员酶修饰优先转录T4开动子。这最终导致噬菌体开动子在邻接阶段的转录（图2a），以优化活病毒颗粒的拼装。本护士生成一个重组T4噬菌体小文库，其中包含驱动sfgfp基因抒发的经受开动子（图2b），并将该结构插入一个已用于T4重组的非必要假定膜卵白（ac基因）中。在大肠杆菌K-12中培养12 h后，用荧光法测定上清液中开释的sfGFP卵白。与穷乏sfgfp基因的非工程T4噬菌体（野生型）比拟，穷乏开动子（无开动子）或使用强构成型大肠杆菌开动子（J23119）并莫得导致更多的sfGFP荧光（图2c）。与野生型T4噬菌体比拟，编码这些开动子的噬菌体滴度缩短轻便两倍，但莫得统计学酷好酷好酷好酷好（图2d）。基于最大sfGFP水和缓对噬菌体滴度影响最小的规范，在接下来的实验中使用gp22开动子。
图2 T4噬菌体开动子对体外坐褥sfGFP的护士
如图3a所示，在饮用水中提供链霉素，用单剂量的大肠杆菌定植，AG百家乐网站然后给以野生型T4噬菌体或T4：：sfgfp噬菌体。细菌和噬菌体共定植4天后，发现两者齐大宗存在（图3b）。荧显豁微镜对未固定肠切片黏膜的荧光定量泄露，T4：：sfgfp噬菌体定植的小鼠比野生型T4噬菌体定植的小鼠的GFP荧显豁耀加多（图3c）。由于自己荧光，野生型T4噬菌体具有低水平荧光，而T4：：sfgfp噬菌体具有大宗粘膜荧光（图3d、e）。为进一步考据GFP荧光定位于粘膜，固定肠说念样本，用WGA和UEA I对DAPI和粘卵白进行染色。效果泄露，野生型T4噬菌体定植小鼠黏膜中的FITC通说念荧光与组织的自己荧光比拟莫得显著变化（图3f）。在更高的放大倍数下，通说念分手（图3g-j）。比拟之下，用T4：：sfgfp噬菌体定植的小鼠有大宗的黏膜GFP荧光（图3k）。更高的放大倍数（图3l）阐述GFP荧光（图3m）加多，共定位于组织管腔侧的粘膜（图3n），远隔细胞核（图3o）。综上效果标明，由噬菌体特异性开动子驱动的异源基因在噬菌体繁衍进程中不错大宗抒发。
图3 通过工程噬菌体在体内产生sfGFP
为了检测T4：：serpin噬菌体产生的serpin在哺乳动物肠说念中的有用性，使用化学磋商的结肠炎小鼠模子（图4a）。如图4b、c所示，粪便中的大肠杆菌和噬菌体水平在实验技巧握续存在，而野生型T4和T4：：serpin之间莫得显耀互异。第9天T4：：serpin惩办的小鼠体重显耀加多（图4d），且粪便NE活性显耀缩短（图4e）。对结肠中性粒细胞的分析泄露，不同噬菌体条目下的中性粒细胞密度同样（图4f），但来自T4：：serpin惩办小鼠的中性粒细胞富含CD24标志物（图4g）。
图4 通过Serpin的产生削弱DSS磋商的结肠炎
为了笃定基于噬菌体设施原位产生ClpB是否会对宿主产生生理磋磨的影响，使用如图5a所示的DIO小鼠模子。粪便噬菌体滴度泄露，野生型T4和T4：：clpB噬菌体均能在小鼠肠说念中保握定植（图5b）。尽管引入了野生型T4或T4：：clpB噬菌体（图5c），粪便大肠杆菌浓度也泄暴露握续的定植（图5c），凸起噬菌体和细菌之间的共存。为深刻了解不雅察到的噬菌体和细菌共存的潜在机制，将粪便大肠杆菌菌落与噬菌体进行交叉杂交，以笃定噬菌体抗性的频率。如图5d、e所示，与野生型T4培养的大肠杆菌比拟，T4：：clpB噬菌体培养的大肠杆菌中抗α-MSH抗体的标志更显著。抗α-MSH抗体通过交叉响应与ClpB纠合。在本实验进程中，与莫得噬菌体或野生型T4噬菌体定植的小鼠比拟，有T4：：clpB噬菌体定植的小鼠体重显耀缩短（图5h）。用T4：：clpB噬菌体定植小鼠的食品徒然量减少（图5I），这与夜间当作加多相关（图5j）。DIO在小鼠模子中导致炎症。与野生型T4噬菌体比拟，T4：：clpB噬菌体定植的小鼠中的几种促炎细胞因子减少，举例IL-1α和IL-1β。其他细胞因子也有所减少，包括单核细胞趋化卵白1（MCP-1）、IL-17A和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），但未达到统计学酷好酷好酷好酷好（图5k）。
图5 T4：：clpB对减少食品徒然和体重加多的功效
小结
要而论之，本护士标明在日常的噬菌体感染进程中，工程毒性噬菌体T4不错诈欺与细菌宿主的共存产生握续的原位效应，合作哺乳动物肠说念中异源卵白的产生和开释。通过工程T4噬菌体在晚期T4噬菌体开动子gp22下抒发sfgfp，发现该说明卵白在体内和体外均显耀抒发。T4产生的卵白酶阻扰剂serpin B1a不错缩短结肠炎技巧小鼠肠说念中的NE活性。终末，护士发现ClpB卵白的抒发不错显耀减少DIO小鼠模子中的体重加多。总之，本护士是一个宗旨说明的考据，即工程毒性噬菌体不错用于原位坐褥异源卵白。
参考文件：Baker, Z.R., Zhang, Y., Zhang, H. et al. Sustained in situ protein production and release in the mammalian gut by an engineered bacteriophage. Nat Biotechnol (2025). https://doi.org/10.1038/s41587-025-02570-7
主编微信
注：添加微信请备注昵称+单元+护士
人命科学详尽交流QQ群:681341860